Estudio realizado en la Universidad de Antioquia, en el 2011:
Germán Andreo Gallego García1; Claudia Milena Trujillo Vargas2; Carlos Guillermo Garcés Samudio3; Carlos Mario Muñetón Peña4; Julio César Orrego Arango5; José Luis Franco Restrepo6
Evaluación citogenética y de pérdida de la heterocigosidad de la región 22q11.2 en pacientes con el síndrome de DiGeorge
Disponible en : http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0121-07932011000300001


MATERIALES Y MÉTODOS:
El presente estudio se efectuó en tres pacientes con diagnóstico de SDG establecido mediante la revisión de historias clínicas y el examen físico. Los datos se consignaron en un formato que incluyó: edad, sexo, número y tipo de infecciones y hospitalizaciones, presencia de enfermedades congénitas en familiares y causas de muerte. El estudio contó con la aprobación del Comité de Bioética de la Sede de Investigaciones Universitarias de la Universidad de Antioquia y con el consentimiento informado de los padres de cada paciente, siguiendo las normas internacionales (17).
Detección de microdeleciones en la región 22q11.2 mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) en linfocitos de sangre periférica
Los núcleos en interfase se obtuvieron a partir de tres mL de sangre periférica anticoagulada con EDTA, que se incubaron con 10 mL de solución hipotónica de KCl al 0,075 M a 37 °C durante 20 minutos para promover la lisis celular; posteriormente se centrifugó a 1.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, se retiró el sobrenadante y se procedió a fijar los núcleos con solución de fijación Carnoy (ácido acéticometanol, relación 1:3).
Para obtener núcleos en metafase, se tomó un mL de sangre anticoagulada, se diluyó en cinco mL de solución RPMI suplementada con suero fetal bovino al 10%, 200 m/mL de penicilina y 200 µ/mL de estreptomicina (RPMI completo) y se procedió a estimular las células con 20 mg/mL de fitohemaglutinina (Sigma Co, St Louis, MO). El cultivo se incubó durante 72 horas a 37 °C en 5% de CO2, luego de lo cual se agregaron 140 mL de N-deacetil-N-metilcolchicina a una concentración de 10 mg/mL (Colcemid, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA) incubando por 40 minutos adicionales a 37 °C en 5% de CO2 con el propósito de inhibir la polimerización de los microtúbulos y, así, desensamblar el huso acromático lo que genera una parada del ciclo celular en metafase. Posteriormente, el cultivo se centrifugó a 1.500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente; luego se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron lentamente y se agregaron gota a gota 10 mL de solución hipotónica de KCl al 0,075 M precalentada para luego incubarlas a 37 ºC por 20 minutos y así promover la lisis celular. Seguidamente se hizo una nueva centrifugación a 1.500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, se retiró el sobrenadante y se procedió a fijar los núcleos con 10 mL de solución de fijación Carnoy fría (-20 ºC) aplicada gota a gota. Se incubó durante 10 minutos en hielo y se centrifugó a 1.500 rpm durante 10 minutos a 4 ºC. La preparación de metafases se almacenó a -20 ºC en solución de fijación.
En varios portaobjetos se aplicaron de manera uniforme tres gotas de la suspensión de los núcleos en interfase o metafase y se dejaron secar; las placas se almacenaron a -20 ºC hasta realizar la hibridación in situ para lo cual se emplearon las sondas SpectrumGreen™ LSI ARSA (que hibridan el gen Arilsulfatasa A, localizado en la región 22q13.3, Figura n.º 1) y SpectrumOrange™ LSI TUPLE I (que flanquea la región 3' no codificadora del gen TUPLE I y las regiones D22S553, D22S609 y D22S942, Figura n.º 1) (Vysis, Abbott Laboratories, Illinois, USA). La hibridación se llevó a cabo aplicando 10 mL de cada sonda y cubriendo inmediatamente la placa con un cubreobjetos, para incubar a 37 ºC por 16-24 horas en la oscuridad. Finalmente, se adicionaron a la placa 10 mL de colorante de contraste 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, por la sigla en inglés de 4-6-diamidino-2- phenylindol) y se hizo la lectura en un microscopio de epifluorescencia, modelo Axyskop 2 dotado con un filtro triple (DAPI/Orange/Green) y con una cámara fotográfica CCD AxioCam MRc, (Carl Zeiss MicroImaging GMBH, Göttingen, Alemania). Se contaron más de 100 núcleos por paciente.
PCR para microsatélites (PCR-STR) en la región 22q11.2
A partir de 3 mL de sangre total se hizo la extracción de ADN empleando el estuche PureGen para extracción de ADN de sangre total (PureGen Technology, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN se almacenó a 4 ºC hasta su uso. Los ADN de pacientes, padres y controles se sometieron a PCR para amplificar los marcadores polimórficos D22S941, D22S944 y D22S264, ubicados en la RCD (figura n.º 1) empleando los siguientes primers: D22S941 = [F- GAG GTT ACA AAG TAC ATT AAC TT], [R- CAA GAA ATG GTT GGA GCT GGT]; D22S944 = [F- CAT GTG AAA GAT GCT ACT TCC], [R- ATC CCA TGA TGC TCC TCC CCA T]; D22S264 = [F- ATT AAC TCA TAA AGG AGC CC], [RCAC CCC ACC AGA GGT ATT CC]. Las PCR se hicieron en un termociclador Geneamp® PCR system 9700 (PE Applied Biosystems, Massachusetts, USA) a partir de 50 ng de ADN genómico/individuo en un volumen total de 25 mL que contenía 10 pmol de cada primer, 4 nmol de deoxinucleótido trifosfato (dNTP) y 0,5 U de Taq polimerasa (Promega, Madison, Wisconsin, USA) en una solución tampón 1X de sulfato de amonio (Promega) bajo las siguientes condiciones: 16 mmol/L [NH4]2SO4, 67 mmol/L Tris, pH 8,8, 0,1% Tween y 1,5 mmol/L MgCl2 (Promega). Las condiciones de la PCR fueron como sigue: desnaturalización inicial a 94 ºC por 5 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturalización (94 ºC por 30 segundos), alineamiento (64,3 ºC por 30 segundos para D22S944 y D22S941 y 62,9 ºC para D22S264) y extensión (72 ºC por 30 segundos) (15).
Para la resolución de las bandas, los productos de PCR se resolvieron por peso molecular en un gel de poliacrilamida al 7,5% y la visualización de las bandas se hizo mediante tinción con nitrato de plata. Los protocolos de tinción se han descrito previamente (18).

RESULTADOS:
Antecedentes clínicos y características fenotípicas de los pacientes con diagnóstico de SDG
Las características fenotípicas de las tres niñas con diagnóstico de SDG se describen en la tabla n.º 1. Todas se diagnosticaron clínicamente durante los dos primeros meses de vida como SDG incompleto. Al momento de la caracterización fenotípica y genotípica, la paciente n.º 1 tenía seis años, la n.º 2, cinco años y la n.º 3, 10 meses de edad. Con respecto a los hallazgos de dismorfismo facial, se observó hipertelorismo en las tres pacientes, implantación baja del pabellón auricular en las pacientes n.º 1 y 2 y telecanto en la paciente n.º 3. Además, en la paciente n.º 1 se detectaron úvula bífida y paladar hendido con retardo del habla y en la n.º 2 se observó paladar duro ojival. En la paciente n.º 3 no se detectó ninguna anormalidad en el sistema bucofaríngeo. En las pacientes n.º 1 y 2 se identificaron cardiopatías troncoconales consistentes en interrupción del arco aórtico tipo B y comunicación interventricular con hipertensión pulmonar; en la otra paciente se identificaron transposición de grandes vasos, comunicación interauricular y ductus arterioso persistente. En las pacientes n.º 1 y 2 se obtuvo evidencia radiológica de sombra tímica reducida de tamaño. Las anormalidades metabólicas en el período neonatal consistieron en hipocalcemia (pacientes n.º 1 y 2), hiperfosfatemia (paciente n.º 1) e hipokalemia (paciente n.º 1) (tabla n.º 1). Además, se registraron anomalías no descritas anteriormente en el SDG como la hernia crural (paciente n.º 2) y la parálisis facial periférica (paciente n.º 3).
FISH para la región 22q11.2
La técnica de FISH reveló una microdeleción hemicigota en las pacientes n.º 1 y 2 en la región 22q11.2 (figura n.º 2, fotografias A y B). Considerando que el diagnóstico de SDG se basa casi exclusivamente en hallazgos clínicos y de laboratorio, estos dos casos se reclasificaron entonces como síndrome por deleción de la región 22q11.2. En la paciente n.º 3 no se pudo detectar la deleción con la sonda Tuple 1 incluso al analizar los núcleos en metafase (figura n.º 2, fotografía C). Considerando que esta sonda solo detecta deleciones proximales al centrómero dentro de la RCD, sería necesario, en el caso de la paciente n.º 3, complementar este estudio genético por FISH empleando sondas o marcadores que detecten deleciones en otras regiones de 22q11.2 y en otros cromosomas que también están asociados al SDG como el 10q13.
Confirmación de la microdeleción cromosómica en la región 22q11.2 mediante PCR para marcadores polimórficos
Se ha propuesto la PCR para marcadores microsatélites como una alternativa para la FISH en SDG, porque puede también determinar con alto poder de resolución la pérdida de heterocigosidad de estos marcadores (15). Dado que esta prueba requiere el análisis del ADN de los padres para comparar los alelos paternos y maternos con los del paciente, no solamente se puede identificar este tipo de defectos cromosómicos y el tamaño de la deleción, sino que también se puede definir el origen parental de esta cuando se sospeche segregación del defecto.
Para este análisis, evaluamos los marcadores polimórficos D22S941, D22S944 y D22S264 en las tres pacientes y en sus respectivos padres. En la paciente n.º 1 se observaron solo una banda para los dos primeros marcadores y dos bandas para el tercer marcador, en contraste con los padres, en quienes se observaron dos bandas en cada uno de los marcadores. Basados en el tamaño de las bandas se concluyó que la paciente heredó un alelo de cada marcador microsatélite de su madre, pero no de su padre. Por lo tanto, la deleción es de origen paterno. La paciente n.º 2 mostró una banda para cada uno de los marcadores, mientras que sus padres mostraron las dos bandas respectivas para cada marcador. La paciente n.º 3 presentó las dos bandas para los tres marcadores, la madre una sola banda para el marcador D22S944 y el padre una sola banda para el marcador D22S264 (figura n.º 3).
En resumen, los resultados sugieren que la paciente n.º 1 es hemicigoto para los marcadores ubicados entre el LCR-A y LCR-B lo cual confirma el resultado de FISH para detectar la deleción. No obstante, en la paciente n.º 2, debido a que los padres presentaban alelos de un tamaño molecular similar para los tres marcadores microsatélites evaluados, no fue posible definir si era homocigoto para los alelos de los microsatélites estudiados o presentaba la deleción. En la paciente n.º 3 no se observó la microdeleción porque es heterocigoto para cada marcador, un resultado que está de acuerdo también con los resultados del FISH.


DISCUSIÓN:
Las aberraciones en la región 22q11 constituyen una de las alteraciones cromosómicas más comunes en humanos y llevan a fenotipos complejos que las convierten en un problema de salud pública importante. Un diagnóstico temprano de la deleción 22q11 en niños con enfermedad cardiovascular congénita permite la detección rápida de las características no cardíacas asociadas para su adecuado tratamiento como también para hacer una consejería genética apropiada.
En el presente estudio se hizo una caracterización citogenética y molecular de tres niñas diagnosticadas clínicamente con SDG incompleto. Cabe resaltar que a pesar de haber hecho el diagnóstico de SDG en los primeros meses de vida, las pacientes n.º 1 y 2 solo pudieron acceder a la caracterización citogenética y molecular del defecto a los seis y cinco años de vida, respectivamente. Esto se debe probablemente a que no se dispone de la prueba FISH para detectar defectos en SDG en casi ninguna de las entidades de salud del país. Por lo tanto, es muy importante diseñar estrategias de diagnóstico genético de SDG que sean rápidas, fáciles de efectuar y económicas para que faciliten los estudios genéticos para este síndrome.
La caracterización fenotípica detallada de las pacientes incluidas en este estudio reveló que las tres tenían los defectos cardíacos comúnmente asociados con el SDG y, lo que es importante, se identificaron dos anormalidades que no habían sido informadas previamente en este síndrome: la hernia crural y la parálisis facial periférica. En las tres pacientes se buscaron microdeleciones en la región 22q11.2 mediante la técnica de FISH pero solo en las pacientes n.º 1 y 2 se encontró la microdeleción por esta técnica; entonces, de acuerdo con la nomenclatura actualmente empleada, estos dos casos se reclasifican como pacientes con síndrome por deleción en la región 22q11.2. Los padecimientos en la paciente n.º 3 se siguen denominando SDG hasta que se detecte su causa genética. Debido a que la sonda Tuple 1 solo detecta deleciones proximales al centrómero dentro de la región crítica del SDG, es necesario complementar este estudio genético empleando otras sondas o marcadores que detecten deleciones en regiones distales y adyacentes y en otros cromosomas que también están asociadas a SDG. Según lo propuesto como alternativa al uso de FISH, la PCR para amplificar marcadores microsatélites puede identificar los defectos genéticos en el SDG y revelar el origen parental y el tamaño de la deleción. En un estudio llevado a cabo con PCR empleando los marcadores D22S941 y D22S944 ubicados entre los LCR-A y -B, y el marcador D22S264 ubicado entre LCR-B y -C, Pereira y colaboradores (15) definieron índices de heterocigosidad para estos tres marcadores (D22S941 y D22S944 con cinco alelos y D22S264 con seis alelos) de 70,8%, 80,4% y 70,4%, respectivamente. Basados en estos datos, los autores calcularon que la PCR-STR usando estos tres marcadores polimórficos tendría un 98% de especificidad para detectar los defectos genéticos en 22q11. En el presente estudio se amplificaron estos microsatélites en ADN de tres pacientes con diagnóstico de SDG y en sus padres. Debido a que el tamaño de las bandas le restó informatividad a los alelos, para la paciente n.º 2 es necesario ampliar el estudio con más microsatélites informativos ubicados en la región 22q11.2, o bien acoplar a este método estudios de cromatografía, que permitan determinar con mayor exactitud el tamaño molecular de cada uno de los alelos parentales y así definir el tamaño de la deleción. Para la paciente n.º 3 también sería importante ampliar el estudio genético en 22q11.2 con más microsatélites ubicados distales al centrómero y entre los LCR B, C y D, para definir si presenta una de las deleciones atípicas en SDG. Sin embargo, mediante esta técnica de PCR se logró establecer que la paciente n.º 1 presentó la segunda deleción de mayor incidencia en el SDG (deleción de 1,5 Mb proximal al centrómero, dentro de la RCD).
Es importante también anotar que la paciente n.º 3 en quien no se pudieron detectar alteraciones en la región cromosómica 22q11 ni por FISH, ni por PCR-STR, se diferencia clínicamente de las otras dos pacientes, pues no presenta alteraciones en el sistema bucofaríngeo ni en el timo, ni había evidenciado defectos neurológicos o alteraciones iónicas que pudieran sugerir un defecto en la glándula paratiroides. Además, sus defectos cardíacos eran diferentes a los de las pacientes n.º 1 y 2. Aunque se ha demostrado que es difícil hacer una correlación genotipo/fenotipo en el SDG, nuestro estudio enfatiza la necesidad de efectuar el diagnóstico genético y establecer el tamaño de la deleción en el SDG. Esta información podría contribuir de manera importante a definir los diferentes genes implicados en las diversas manifestaciones clínicas en SDG.
Proponemos entonces el uso de la PCR-STR como ayuda diagnóstica para rastrear deleciones en la región 22q11.2 en pacientes con evidencia clínica de SDG. Ampliando el número de microsatélites evaluados y adaptando esta técnica a métodos cromatográficos que permitan definir con mayor exactitud los alelos presentes tanto en los padres como en los pacientes sospechosos, la PCR-STR podría ser una alternativa más fácil, más económica e igualmente confiable para los estudios genéticos en SDG además de permitir caracterizar el origen parental y el tamaño de las deleciones en comparación con el FISH, que en estos momentos es el estándar de oro para los estudios genéticos en este síndrome.